M6米乐北京化工大学团队在酵母中高碳生产3-羟基丙酸接近最大理论产量3-羟基丙酸（3-HP）是潜在的第三大生物基平台化合物，以它为底物能够合成多种具有商业潜质的生物制品，尤其受到市场关注的是，它很容易脱水成丙烯酸酯，丙烯酸酯是生产合成聚合物（如一次性尿布中使用的超吸收剂）的关键成分。

　　迄今为止在 3-HP 与底物（葡萄糖）比率方面达到的最佳产量约为 0.31 g/g，仅为最大理论产量的 39.7%，远远达不到 3-HP 到丙烯酸酯生产的商业要求。

　　在全球范围内，利用代谢工程技术合成 3-HP 已成研究热点，工程酵母成为生物丙烯酸商业化的基础。目前，3-HP 的生产难以达到工业生产规模，主要障碍是产率低。需要寻找以 CO₂ 为唯一碳源高产率合成 3-HP 的新策略。

　　在细胞内，根据 pH 和盐度的变化，无机碳可以在以下四种形式间相互转化，分别是溶解的 CO₂、碳酸、碳酸氢盐和碳酸盐。细胞质中的 pH 值大约为中性，则无机碳主要以碳酸氢盐的形式存在。

　　碳酸氢盐可以通过天然羧化反应捕获，在酵母中存在的高通量路径是：由乙酰辅酶 A 羧化酶 Acc1 催化乙酰辅酶 A 羧化，生成的丙二酰辅酶 A 可以转化为 3-HP。

　　此前，人们普遍认为乙酰辅酶 A 和丙二酰辅酶 A 的前体以及氧化还原辅因子和 ATP是 3-HP 生产的关键要求。而此项研究使用Yeast8 模型计算分析发现，碳酸氢盐的供应是限制 3-HP 高产的重要因素。

　　分析结果指出，碳酸氢盐的通量应比底物（葡萄糖）高 1.562 倍，以实现 3-HP 的最大产量。

　　▲图丨丙二酰辅酶 A 还原酶途径用于产生 3-HP。转录因子 Stb5 可以实现从糖酵解到oxPP途径的碳通量重新布线（来源：Nature Communications）

　　细胞的天然代谢无法提供理想的碳酸氢盐通量，也就是说，用来生产 3-HP 的碳酸氢盐是缺乏的。为了确保为 Acc1 羧化提供充足的碳酸氢盐供应，同时最大限度地减少乙酰辅酶 A 和能量产生过程中的 CO₂ 损失。研究人员首先建立了一个从葡萄糖到 3-HP 的碳守恒循环，可以有效地回收损失的碳，以提高 3-HP 生产的理论碳产量。

　　接下来，为了在产生乙酰辅酶 A 的同时减少 CO₂ 释放，研究人员整合了之前研究中报道的磷酸酮醇酶（PK）途径，此外还引入了 S659A 和 S1157A 两个位点突变阻止 Acc1 被磷酸化，从而激活了 Acc1 的活性。

　　为了通过 PK 途径实现更高的通量，研究人员转向转录因子（TF）来研究单个基因修饰是否可以实现总体碳通量重新分布。值得注意的是米乐m6手机版，很多其他研究选择广泛的基因型修饰来达成该目的。

　　Stb5 是一种 TF 和 NADPH 调节剂，可抑制 PGI1 的表达，编码葡萄糖 6-磷酸糖酵解的限速反应，以重新连接从糖酵解到氧化戊糖磷酸（oxPP）途径的通量。研究人员构建了一个人工启动子来替代STB5的天然启动子，这一操作将工程菌株的 3-HP 产量提高至 0.74 g/L米乐m6手机版。

　　通过对 SLC4 和 SLC26 家族的关键物种进行系统发育分析，证明了 Sul1 作为碳酸氢盐转运蛋白的潜力以及细胞内碳酸氢盐可用性对于 3-HP 生产的重要性。

　　为了提高丙二酰辅酶 A 向 3-HP 的转化，研究人员首先以不同的组合表达 MCR-N 和 MCR-C，并使用更高拷贝数的质粒表达 MCR-N 结构域和MCR-CN941V K1107W S1115R结构域，将 3-HP 产量增加至 4.12 g/L。另一方面，研究人员尝试减少其他反应支路（脂肪酸合成）对丙二酰辅酶 A 的消耗；同时还上调了β-氧化途径，将已合成的脂肪酸分解回 NADPH 和乙酰辅酶 A 用于合成 3-HP。

　　在以上操作的基础上，想要进一步提高工程菌株的 3-HP 产量，还需要提高菌株对 3-HP 的耐受性以及利于 3-HP 的转运。

　　此研究通过过表达ESBP6（一种与单羧酸通透酶相似的蛋白质）将 3-HP 的产量提高至 6.39 g/L。验证了 Esbp6 可以帮助将 3-HP 转运到细胞外，从而增加酵母的耐受性并提高 3-HP 的产量。

　　能量对于 3-HP 产量至关重要，研究人员通过磷酸肌醇（Inositol phosphate）的应用，采用 5-InsP 7 机制来提高 ATP 的产生率，还实施了减少能源消耗的方法。为了防止 3-HP 降解则删除了菌株中的UGA1。

　　▲图丨生产范围与本研究报告的关键 3-HP 生产结果相结合（来源：Nature Communications）

　　总的来说，研究人员对天然碳酸氢盐代谢的彻底分析和重新布线以及外部碳酸氢盐供应的策略，能够实现 3-HP 的碳酸氢盐流入量相当于葡萄糖的流入量。最终，在工程菌株中，3-HP 底物产量达到 0.5625 g/g，相当于理论产量的 89.3%。

　　目前，关于生物燃料的使用对全球 CO₂ 排放的净影响仍存在争论。生物基商品大宗化学品的生产途径还必须减少葡萄糖氧化过程中 CO₂ 的释放，才能具有商业潜力。这项研究使用多策略方法高碳生产 3-HP，为生物燃料和生物基化学品生产的可持续和循环碳经济的发展起到推动作用。

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